POP（盆腔器官脫垂）顯著影響女性的健康和生活質(zhì)量，目前尚無最佳治療方法。子宮骶韌帶為子宮上部和陰道提供頂端支撐，在POP中發(fā)揮著不可或缺的作用。盡管POP已被廣泛研究，但其關(guān)鍵機(jī)制尚未完全闡明。特別是，免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC和中性粒細(xì)胞）在POP病理學(xué)中的作用尚不清楚。

那么今天和小伙伴們共同學(xué)習(xí)一篇發(fā)表在《CommunBiol》上的文章。這篇文章利用單細(xì)胞測序，在子宮骶韌帶中測量基因表達(dá)水平，以期更深入地理解POP的發(fā)病機(jī)制。這篇文章究竟運(yùn)用了哪些創(chuàng)新方法，又有哪些突破性的發(fā)現(xiàn)呢？一起來揭秘吧～

1、首次構(gòu)建POP的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。

2、本研究利用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq），使用數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)工具，為揭開POP的神秘面紗提供了新的指導(dǎo)。

題目：子宮骶韌帶的單細(xì)胞分析揭示了盆腔器官脫垂女性的細(xì)胞異質(zhì)性

雜志：CommunBiol

影響因子：IF=5.9

發(fā)表時(shí)間：2024.02.07

盆腔器官脫垂(POP)是女性盆腔器官（陰道、膀胱、子宮和/或直腸）因其相關(guān)支持組織薄弱而導(dǎo)致的移位。它是一種流行的、負(fù)擔(dān)性的、限制性的疾病，會(huì)帶來巨大的身體和情感不適以及巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。全球POP的患病率為3-6%，16個(gè)發(fā)展中國家為19.7%，中國為9.67%，美國為2.9%。而子宮骶骨韌帶(USL)在POP中對子宮和上陰道的頂端支撐起著不可或缺的作用。與連接骨骼的骨骼韌帶不同，USL是一種類似于腸系膜的內(nèi)臟韌帶，由平滑肌、血管、神經(jīng)、脂肪組織和疏松結(jié)締組織組成。

首先，作者通過scRNA測序獲得POP和對照樣本中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜；其次，作者將注釋到的細(xì)胞進(jìn)行亞群分析和逆時(shí)序分析；最后還探索了POP和對照樣本的細(xì)胞間相互作用以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

1、POP和對照樣本中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

作者通過scRNA測序獲得了30,452個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，根據(jù)標(biāo)記基因，總共注釋到10種細(xì)胞類型：平滑肌細(xì)胞（34.93%）、內(nèi)皮細(xì)胞（21.29%）、成纖維細(xì)胞（17.36%）、中性粒細(xì)胞(4.92%)、巨噬細(xì)胞(5.36%)、單核細(xì)胞(4.05%)、肥大細(xì)胞(6.60%)、T細(xì)胞(3.70%)、B細(xì)胞(0.85%)和樹突狀細(xì)胞(DC)(0.94%)（如圖1c）。與對照組相比，POP組巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量增多，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示這些細(xì)胞在POP的病理生理機(jī)制中發(fā)揮作用（圖1d)。為了了解USL中每種細(xì)胞類型的功能，作者分析了前10個(gè)DEG（圖1e）并進(jìn)行GO功能富集分析（補(bǔ)充圖2）。平滑肌細(xì)胞(SMC)富含線粒體途徑，而單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、DC和T細(xì)胞中的細(xì)胞外基質(zhì)途徑則下調(diào)。此外，作者還篩選了所有細(xì)胞類型中的DEG（圖1f），富集分析顯示，與對照樣本相比，POP組的細(xì)胞類型在含膠原ECM、肌肉系統(tǒng)過程、中性粒細(xì)胞激活等相關(guān)通路中富集，令人驚訝的是，SMC下調(diào)了ECM組織途徑（補(bǔ)充圖3）。

2、基質(zhì)細(xì)胞的表征

基質(zhì)細(xì)胞是USL中的主要細(xì)胞，占細(xì)胞群的73.58%，因此作者對三種類型的基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞（圖2）、平滑肌細(xì)胞（圖3a-3f）、內(nèi)皮細(xì)胞（圖3g-3j））進(jìn)行了亞群分析和逆時(shí)序分析。

成纖維細(xì)胞被標(biāo)記為S3FRP1+成纖維細(xì)胞、FGBP2+成纖維細(xì)胞、PCP4+肌成纖維細(xì)胞、PGS5+壁細(xì)胞和SLPI+成纖維細(xì)胞（圖2a），且POP中PCP4+肌成纖維細(xì)胞減少，其他簇的比例沒有顯著變化（圖2c），富集分析發(fā)現(xiàn)PCP4+肌成纖維細(xì)胞高表達(dá)肌肉收縮相關(guān)基因，例如ACTA2和ACTG2。

SMC被分為四個(gè)細(xì)胞簇（圖3a），分別是SMCs1（ATF3?+SMCs）、SMCs2（暫時(shí)標(biāo)記為CTR9?+SMCs）、SMCs3（CFHR1?+SMCs），與正常組織相比，POP中SMCs2的比例顯著增加，而SMCs3的比例下降（圖3b），且CFHR1?+SMCs在免疫效應(yīng)過程途徑的調(diào)節(jié)中富集。

內(nèi)皮細(xì)胞被分為淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（AEC）和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）（圖3g），POP組中AEC的比例增加（圖3h)，作者還發(fā)現(xiàn)AEC在肌動(dòng)蛋白結(jié)合途徑中富集。

3、骨髓細(xì)胞的表征

POP組和對照組之間的免疫細(xì)胞浸潤類型存在顯著差異。除USL中的基質(zhì)細(xì)胞外，骨髓細(xì)胞是最大的細(xì)胞群。POP組中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞增加（圖1d）。

通過巨噬細(xì)胞的無監(jiān)督聚類分析獲得了四個(gè)聚類，它們都高度表達(dá)應(yīng)激反應(yīng)基因，例如DNAJB1、HSPA1A、HSPA1B和一些細(xì)胞因子基因。按比例來看，POP樣本中巨噬細(xì)胞1、2和4顯著增加，而巨噬細(xì)胞3顯著減少（圖4b)。富集分析表明巨噬細(xì)胞3可能是M1亞型，中性粒細(xì)胞活化和白細(xì)胞趨化等途徑在巨噬細(xì)胞3中富集（圖4d）,GO功能富集分析表明，巨噬細(xì)胞1富集了應(yīng)激相關(guān)通路，巨噬細(xì)胞2富集了脂蛋白顆粒結(jié)合和細(xì)胞基質(zhì)粘附通路（圖4d)。第四個(gè)簇只有22個(gè)細(xì)胞和高表達(dá)的CHIT1，這是與纖維化相關(guān)的巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志物。

單核細(xì)胞分為四個(gè)簇（圖4e），POP樣本中單核細(xì)胞1顯著增加，單核細(xì)胞3、4顯著減少（圖4f-g)。作者發(fā)現(xiàn)幾乎所有單核細(xì)胞都表達(dá)CD14，只有單核細(xì)胞3表達(dá)CD16/FCGR3A（補(bǔ)充圖5）。據(jù)此認(rèn)為單核細(xì)胞3是中間單核細(xì)胞（CD14+CD16+），其余的是經(jīng)典單核細(xì)胞（CD14+?CD16-/低）。單核細(xì)胞3在氧化磷酸化、RNA分解代謝過程和中性粒細(xì)胞激活途徑中富集（圖4h），單核細(xì)胞1高表達(dá)IRAK2、CD72和CCL20等炎癥相關(guān)基因，并富含I-kappaB激酶/NF-kappaB信號、內(nèi)在凋亡信號通路等（圖4h）。單核細(xì)胞2高表達(dá)JUN、FOS和ATF3轉(zhuǎn)錄因子和早期反應(yīng)基因家族（EGR1、IER2），這些基因在應(yīng)激相關(guān)通路中富集。單核細(xì)胞4主要富集于金屬離子反應(yīng)。

此外，逆時(shí)序分析顯示了從經(jīng)典單核細(xì)胞到中間單核細(xì)胞，然后到巨噬細(xì)胞或DC的發(fā)育軌跡。另外IL1RN、IL1B和CCL20在逆時(shí)序開始時(shí)上調(diào)，F(xiàn)OS、JUN和補(bǔ)體相關(guān)基因（C1QA、C1QB和C1QC）在接近結(jié)束時(shí)上調(diào)（圖5c）。RNA速度分析表明單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都有指向DC的RNA速度向量（圖5d）。

對POP組中的中性粒細(xì)胞的進(jìn)一步分析揭示了四個(gè)具有不同基因表達(dá)譜的簇（圖5e）。POP組中性粒細(xì)胞數(shù)量增加（圖5f）。進(jìn)一步作者發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞1具有G2-5a亞群的特征，中性粒細(xì)胞2符合G5c亞群，中性粒細(xì)胞3符合G5b亞群。

4、POP和對照樣品中的細(xì)胞間相互作用模式

細(xì)胞間相互作用分析表明，在基質(zhì)細(xì)胞中觀察到成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的強(qiáng)烈相互作用（圖6a），在免疫細(xì)胞中觀察到中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC和單核細(xì)胞之間存在密集的通訊網(wǎng)絡(luò)。此外，還分別鑒定了對照組和POP組中的受體-配體對（圖6b-c），與對照組相比，POP組的細(xì)胞間相互作用減弱，尤其是成纖維細(xì)胞與EC、中性粒細(xì)胞和MP之間的相互作用（圖6d）。

因此，作者探索了EC和成纖維細(xì)胞之間的特定相互作用（圖6e）。對照組中，成纖維細(xì)胞分泌大量MMP2、FN1、LAMC1和OMD等膠原蛋白樣基因與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。此外，EPHB4_EFNB1、FLT1復(fù)合物_PGF、VEGFA_FLT1和VEGFD_KDR受體-配體對促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長。EC和成纖維細(xì)胞通過FGFR1_FGF7和FGFR1_NCAM1受體-配體對促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長和發(fā)育。

與對照組相比，POP組USL中性粒細(xì)胞顯著增加（圖1d），并且中性粒細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞之間存在豐富的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)。

5、POP和對照樣本中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

最后，作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析來評估USL中TF的表達(dá)并識別關(guān)鍵TF。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)的NFATC2，肥大細(xì)胞和T細(xì)胞中高表達(dá)的GATA3，T細(xì)胞中高表達(dá)的STAT4均能促進(jìn)T細(xì)胞分化（圖7a）。對這些TF進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)MYBL2、GATA3和ARID3A在淋巴細(xì)胞分化和髓系白細(xì)胞分化調(diào)節(jié)方面富集（圖7b）。此外，作者還研究了POP組中的TF。中性粒細(xì)胞特異性TF與對照組相同，然而，表達(dá)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖7a-b）。單核細(xì)胞的幾種特定轉(zhuǎn)錄因子，如OLIG1、CEBPE、POU2F2和NFE2，均在中性粒細(xì)胞激活中富集（圖7c-d）。對照組和POP組的基質(zhì)細(xì)胞的TF在功能上趨于相似，并且都與特定細(xì)胞的發(fā)育、分化和增殖有關(guān)。

此研究首次利用scRNA-seq探索POP和正常USL的細(xì)胞類型組成和異質(zhì)性，揭示了POP樣本USL組織中免疫細(xì)胞浸潤的景觀。作者發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互促進(jìn)生長、增殖和發(fā)育，描述了免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞如何通過受體-配體對相互溝通。此外，還發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)ECM、細(xì)胞發(fā)育和免疫反應(yīng)的重要TF。這篇文章的單細(xì)胞分析的思路很經(jīng)典，對一些分析結(jié)果的可視化的解讀非常具體，所以對這些可視化的解讀有疑慮的小伙伴們快來看看吧！