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 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指在妊娠20-24周之前發(fā)生兩次或兩次以上流產(chǎn)，是影響人類(lèi)生殖健康的一種普遍且重要的病理狀況。然而，RPL的潛在機(jī)制仍不清楚。本研究旨在研究與RPL相關(guān)的生物標(biāo)志物和分子機(jī)制，并探索臨床應(yīng)用的新治療策略。

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作者利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RPL基因表達(dá)譜并進(jìn)行差異表達(dá)分析、WGCNA、功能富集以及使用LASSO回歸、SVM-RFE和隨機(jī)森林對(duì)RPL基因表達(dá)進(jìn)行分析；構(gòu)建ANN模型來(lái)評(píng)估數(shù)據(jù)集中hub基因的性能；通過(guò)RT-qPCR來(lái)驗(yàn)證RPL和對(duì)照組中hub基因的表達(dá)；接著進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、泛癌分析，并使用CMap進(jìn)行小分子藥物篩選，流程見(jiàn)圖1。

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1、RPL中的DEG鑒定、功能富集及WGCNA分析

對(duì)GSE165004進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得198個(gè)上調(diào)基因和154個(gè)下調(diào)基因（圖2A）。接著，作者針對(duì)DEG做了GO、KEGG、GSEA富集分析，結(jié)果表明了代謝途徑紊亂可能與RPL發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。然后，作者從GSE165004中總共選擇了20,552個(gè)基因進(jìn)行WGCNA，結(jié)果顯示，turquoise模塊與RPL關(guān)系最密切（r=-0.42，p=0.003）（圖3E），共包含1,990個(gè)基因。

2、樞紐生物標(biāo)志物的鑒定

turquoise模塊中總共包含104個(gè)DEG，LASSO回歸提取了3個(gè)hub基因（WBP11、ACTR2和NCSTN）（圖4A、B）；SVM-RFE篩選WBP11、SUGT1、CISD2、ACTR2、C2orf69和NCSTN作為中心特征（圖4C、D）；隨機(jī)森林確定了7個(gè)重要性得分>1.0的基因作為RPL的潛在診斷生物標(biāo)志物：WBP11、ACTR2、SUGT1、NCSTN、C2orf69CISD2和DHX33（圖4E、F），這三種算法（ACTR2、NCSTN和WBP11）之間有3個(gè)生物標(biāo)志物重疊（圖4G）?；谌齻€(gè)hub基因構(gòu)建了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（圖4H）。

3、中樞生物標(biāo)志物和ANN模型的診斷功效

使用ROC曲線(xiàn)評(píng)估3個(gè)hub基因的診斷功效。如圖所示，在測(cè)試集GSE165004和驗(yàn)證集GSE183555中，WBP11的AUC值為1.00和0.60（圖5A）。ACTR2的AUC值為0.99和0.60（圖5B），NCSTN的值為0.99和0.52（圖5C）。ROC結(jié)果表明，ANN模型可以有效區(qū)分RPL和對(duì)照，測(cè)試集GSE165004的AUC值為1.00，驗(yàn)證集GSE183555的AUC值為0.74（圖5D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，三種生物標(biāo)志物的聯(lián)合使用有助于提高診斷準(zhǔn)確性。

4、中心生物標(biāo)志物的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證hub基因的mRNA和蛋白表達(dá)，作者收集了20名對(duì)照患者和20名RPL患者的蛻膜樣本。RT-qPCR結(jié)果顯示，RPL組WBP11mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組（圖6A）。ACTR2mRNA的相對(duì)表達(dá)量也低于對(duì)照組，而NCSTNmRNA的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（圖6B、C）。

5、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果

作者使用CIBERSORT進(jìn)一步研究了RPL和對(duì)照組中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖7A）。與對(duì)照組相比，RPL組M1和M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)水平顯著降低（圖7B）。值得注意的是，結(jié)果中未檢測(cè)到CD4初始T細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)。相關(guān)分析顯示，嗜酸性粒細(xì)胞與靜息肥大細(xì)胞呈強(qiáng)正相關(guān)（r=0.74），而M0巨噬細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.59）。圖7C）。使用Spearman相關(guān)分析進(jìn)一步研究了三個(gè)hub基因與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。結(jié)果表明，WBP11與M2巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，而與濾泡輔助T細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)呈負(fù)相關(guān)。圖8A、D-G）。ACTR2與M1巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)（圖8B、H）。NCSTN與CD8T細(xì)胞和Tregs呈正相關(guān)，與活化的樹(shù)突狀細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖8C，I-M）。

6、Hub生物標(biāo)志物的泛癌分析結(jié)果

從不同的樣品中提取三個(gè)hub基因的表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)WBP11在24種腫瘤類(lèi)型（GBM、GBMLGG、LGG、BRCA、CESC、ESCA、STES、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、OV、PAAD、TGCT、UCS、ALL、LAML、ACC和CHOL），并且在LUAD、KIRP和THCA中顯著下調(diào)（圖9A）。使用Cox回歸顯示，LAML和LUAD中WBP11高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，而KIRC和READ中WBP11低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖9C-F）。

ACTR2在28種腫瘤類(lèi)型（GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、BRCA、CESC、LUAD、ESCA、STES、KIPAN、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、BLCA）中表現(xiàn)出高表達(dá)、THCA、OV、PAAD、TGCT、UCS、LAML、CHOL），而KIRP和KICH中觀察到低表達(dá)（補(bǔ)充圖2A）。在GBMLGG、LGG、LAML、CESC、LUAD、KIRP、KIPAN、LIHC、MESO、PAAD、LAML和ACC中，ACTR2充當(dāng)危險(xiǎn)因素，而在KIRC和NB中充當(dāng)保護(hù)因素（補(bǔ)充圖2B-F）。

NCSTN基因表達(dá)在30種腫瘤類(lèi)型中上調(diào)，包括GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、BRCA、CESC、LUAD、ESCA、STES、COAD、COADREAD、PRAD、STAD、HNSC、KIRC、LUSC、LIHC、WT、SKCM、BLCA、THCA、OV、PAAD、TGCT、UCS、ALL、LAML、PCPG、ACC和CHOL，而在KICH中顯著下調(diào)（補(bǔ)充圖3A）。在預(yù)后分析中，NCSTN的高表達(dá)與GBMLGG、LGG、LAML、CESC、LUAD、KIRP、KIPAN、GBM、LIHC、UVM、LAML和PCPG等12種癌癥的總生存率較差相關(guān)（補(bǔ)充圖3B-F）。

7、RPL相關(guān)小分子藥物

使用CMap，作者研究了與RPL相關(guān)的小分子藥物，并鑒定了總共17種化合物。表4顯示與RPL相關(guān)性最高的前10種藥物。值得注意的是，乙酸胍和阿多拉嗪與RPL表現(xiàn)出很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，表明它們?cè)谥委熯@種疾病方面的潛在價(jià)值。

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這篇文章利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)、機(jī)器學(xué)習(xí)、WGCNA以及RT-qPCR確定了WBP11、ACTR2和NCSTN為RPL的診斷生物標(biāo)志物，并且這三個(gè)hub基因與各種惡性腫瘤密切相關(guān)。同時(shí)，RPL中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)存在不平衡，并為RPL的潛在機(jī)制以及該疾病治療靶點(diǎn)的潛在開(kāi)發(fā)提供了新的見(jiàn)解。性?xún)r(jià)比極高的一篇高分文章，大家趕緊學(xué)起來(lái)吧！