研究背景

牙周炎是一種相當(dāng)常見的疾病，它是由菌斑生物膜失調(diào)引起的，并因宿主過度的免疫炎癥反應(yīng)而加劇。盡管近年來牙周炎的治療方法取得了進(jìn)展，但有效的治療方法仍然難以找到。牙周炎的病因復(fù)雜，微量金屬元素失衡和線粒體功能障礙可能是其誘因。例如，鋅穩(wěn)態(tài)可能具有抗菌作用，并可能保護(hù)牙周骨組織。然而，牙周炎期間牙周組織細(xì)胞內(nèi)銅水平的差異仍不清楚。目前，只有少數(shù)研究調(diào)查了牙周炎中的銅穩(wěn)態(tài)失衡。

數(shù)據(jù)來源

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得8753個(gè)與線粒體功能障礙相關(guān)的基因，選取相關(guān)性得分>7的1006個(gè)基因作為線粒體功能障礙相關(guān)基因集。

17個(gè)CRG：FDX1、LIPT1、LIAS、DLD、PDHA1、PDHB、DLAT、SLC31A1、ATP7A、ATP7B、GLS、MTF1、CDKN2A、SLC25A3、GCSH、DBT、DLST。

研究思路

本研究通過生物信息學(xué)分析研究了差異表達(dá)的CRG（DE-CRG）對(duì)牙周炎的綜合影響。使用正常和牙周炎牙齦樣本發(fā)現(xiàn)了9個(gè)DE-CRG，并分析了單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)以識(shí)別它們?cè)诓煌?xì)胞簇中的變化。然后作者檢測(cè)了DE-CRG與免疫浸潤(rùn)、免疫因素、線粒體功能障礙、診斷功效和預(yù)測(cè)藥物之間的相關(guān)性。此外，還證實(shí)了整個(gè)牙周炎組織和人牙齦成纖維細(xì)胞系（HGF-1）中DE-CRG的變化，并研究了HGF-1細(xì)胞中銅含量的變化。

圖1

主要結(jié)果

將GSE10334和GSE16134結(jié)合，獲得557個(gè)樣本的表達(dá)譜。使用R確定了6506個(gè)DEGs（圖2A和B）。接下來，將17個(gè)CRG映射到DEGs，并獲得了9個(gè)與牙周組織相關(guān)的DE-CRG（圖2C-E）。

采用GO和KEGG分析探索DE-CRGs潛在的生物學(xué)功能和途徑?；贕O分析，DE-CRGs主要富集在生物過程（BP）術(shù)語細(xì)胞氨基酸代謝過程、細(xì)胞氨基酸分解代謝過程、α氨基酸代謝過程、有機(jī)酸分解代謝過程、羧酸分解代謝過程、小分子分解代謝過程、二羧酸代謝過程、賴氨酸代謝過程和賴氨酸分解代謝過程；細(xì)胞成分（CC）術(shù)語線粒體基質(zhì)、氧化還原酶復(fù)合物、三羧酸循環(huán)酶復(fù)合物、二氫硫辛酰脫氫酶復(fù)合物；和分子功能（MF）術(shù)語過渡金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（圖2F）。KEGG通路分析表明，DE-CRGs參與了碳代謝、TCA循環(huán)、礦物質(zhì)吸收、乙醛酸和二羧酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等（圖2G與線粒體密切相關(guān)的各種生物活動(dòng)。

圖2

使用在線ChEA3數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DE-CRGs進(jìn)行了TF富集分析。結(jié)果表明，與DE-CRGs相關(guān)的TF分布在各種組織中，例如腦、血液、脂肪組織、睪丸和肌肉（圖3A）。TF參與轉(zhuǎn)錄、DNA模板、動(dòng)物器官形態(tài)發(fā)生、免疫反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元發(fā)育（圖3A）。FOS是頻率富集分?jǐn)?shù)(FET)具有最高P值的TF（圖3B）。結(jié)果表明，與DE-CRG相關(guān)的TF與基因的生物學(xué)功能相一致。

圖3

為了識(shí)別蛋白質(zhì)關(guān)系，選擇了變異倍數(shù)較大的基因（|logFC|最大的500個(gè)基因）與9個(gè)DE-CRGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，DE-CRGs之間存在多種相互作用，蛋白質(zhì)之間的相互作用非常復(fù)雜。與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)MTF1、SLC31A1和ATP7A相關(guān)的3個(gè)DE-CRGs表現(xiàn)出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。另外6個(gè)DE-CRGs與脂?；腡CA循環(huán)蛋白相關(guān)，也表現(xiàn)出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（圖3C）。

隨后作者使用Metascape對(duì)這509個(gè)基因進(jìn)行了功能分析，富集的通路包括適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)、金黃色葡萄球菌感染和瘧疾等（圖3D）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了功能相似的蛋白質(zhì)之間的相互作用與蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能相一致。

由于牙周炎常伴有免疫系統(tǒng)的激活和反應(yīng)，因此采用CIBERSORT算法分析了牙周組織中22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例。與對(duì)照組相比，牙周炎組的漿細(xì)胞、記憶激活的CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、γδT細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞明顯增多。然而，牙周炎組的記憶B細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞明顯減少（圖3E）。在牙周組織中的22種免疫細(xì)胞之間觀察到了幾種顯著的相關(guān)性（補(bǔ)充圖2B）。

分析牙周炎中DE-CRGs與免疫細(xì)胞的關(guān)系，進(jìn)一步探索了DE-CRGs影響牙周炎進(jìn)展的潛在機(jī)制（圖3F）。另外，為了進(jìn)一步證實(shí)DE-CRGs與免疫系統(tǒng)之間的相關(guān)性，還研究了DE-CRGs與不同免疫因子如趨化因子、免疫刺激劑、免疫抑制劑、主要組織相容性復(fù)合體（MHC）和細(xì)胞受體之間的相關(guān)性（圖4）。這些分析表明，DE-CRG與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

圖4

牙槽突下垂通常伴有線粒體功能障礙。因此，使用ssGSEA算法評(píng)估了DE-CRGS與線粒體功能障礙相關(guān)基因集之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，7個(gè)DE-CRG（ATP7A和GLS除外）的表達(dá)水平與ssGSEA評(píng)分呈高度相關(guān)。MTF1表達(dá)與線粒體功能障礙的相關(guān)性最強(qiáng)（圖5）。這些結(jié)果表明，DE-CRG對(duì)牙周炎進(jìn)展的影響與線粒體功能障礙密切相關(guān)。

圖5

使用ROC曲線分析DE-CRGs的診斷效果，AUC值分別為：GCSH：0.8349；SLC31A1：0.7925；MTF1：0.7821；DLD：0.7785；DBT：0.7485；LIAS：0.7381；ATP7A：0.7372；GLS：0.7277；DLST：0.669（圖6A-I）。結(jié)果提示，這9個(gè)DE-CRGs與牙周炎預(yù)測(cè)密切相關(guān)。

圖6

為了進(jìn)一步探索九種DE-CRG在牙周炎中的臨床潛力，利用DGIdb數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了臨床藥物預(yù)測(cè)分析，共獲得了77對(duì)基因-藥物關(guān)系對(duì)（4個(gè)基因和76種藥物）（圖6J）。此外，根據(jù)免疫浸潤(rùn)分析的結(jié)果，提取了55對(duì)基因-免疫細(xì)胞關(guān)系（4個(gè)基因，22個(gè)免疫相關(guān)細(xì)胞），以更好地闡明這些藥物的作用機(jī)制（圖6J）。GLS基因與15種免疫細(xì)胞相關(guān)，包括記憶B細(xì)胞、記憶激活CD4+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明了開發(fā)用于牙周炎治療的新型藥物的潛力。

為了研究不同牙周組織細(xì)胞類型中DE-CRG表達(dá)的變化，作者分析了scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)集(GSE164241)。與HC組相比，PD組的內(nèi)皮細(xì)胞1、內(nèi)皮細(xì)胞2、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞均減少。HC組和PD組13個(gè)主要細(xì)胞簇中DE-CRG的表達(dá)水平如圖7E所示?？傮w而言，在三個(gè)細(xì)胞簇中觀察到DE-CRG表達(dá)的顯著變化：黑色素細(xì)胞_PD、成纖維細(xì)胞_PD和內(nèi)皮細(xì)胞1_PD。為了進(jìn)一步觀察DE-CRG表達(dá)的變化，作者檢查了各種髓系細(xì)胞中的另外13個(gè)細(xì)胞簇（圖8A），在多發(fā)性髓系細(xì)胞中未觀察到DE-CRG表達(dá)的顯著差異，而在成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞簇中觀察到表達(dá)的顯著變化（圖8C）。

圖7

圖8

人牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦結(jié)締組織中最豐富的細(xì)胞，對(duì)牙周組織重塑和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。為了證實(shí)全組織和細(xì)胞亞群中DE-CRG的差異，作者采用RT-qPCR檢測(cè)人牙齦組織和HGF-1細(xì)胞中DE-CRGmRNA的表達(dá)水平。除DLST基因外，人牙周組織中DE-CRG mRNA的表達(dá)水平與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致（圖8D ）。在用Pg -LPS處理的HGF-1細(xì)胞中，DE-CRGmRNA表達(dá)水平與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致；即所有DE-CRGs的mRNA表達(dá)水平均上調(diào)（圖8E）。選取與線粒體功能障礙相關(guān)的基因MTF1、LIAS、SLC31A1，在人牙周組織中驗(yàn)證其蛋白表達(dá)水平，其在人牙周組織整體中的蛋白表達(dá)水平與生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致（圖8H、I）。作者還檢測(cè)了Pg -LPS處理后HGF-1細(xì)胞內(nèi)銅含量的變化，HC組和Pg - LPS組細(xì)胞內(nèi)銅含量平均分別為0.44和1.35μmol/gprot（圖8F ），Pg -LPS組細(xì)胞內(nèi)銅含量比HC組高約3倍（圖8G）。這些結(jié)果提示，組織整體中DE-CRG的表達(dá)水平與特定細(xì)胞簇中的表達(dá)水平不同，牙周炎中細(xì)胞內(nèi)銅含量增加。

文章小結(jié)

作者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)牙周炎組織中存在9個(gè)DE-CRGs，表明某些牙周炎組織細(xì)胞含有過量的銅。但大多數(shù)DE-CRG趨勢(shì)與杯狀凋亡不一致，從而推測(cè)杯狀凋亡并不一定發(fā)生。而且這些DE-CRG與免疫浸潤(rùn)和免疫因素、線粒體功能障礙、臨床診斷效能和預(yù)測(cè)性治療藥物密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為牙周炎的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的見解。